Пептиды — это класс соединений, образующихся в результате соединения нескольких аминокислот посредством пептидных связей.Они повсеместно распространены в живых организмах.К настоящему времени в живых организмах обнаружены десятки тысяч пептидов.Пептиды играют важную роль в регуляции функциональной активности различных систем, органов, тканей и клеток, а также в жизнедеятельности и часто используются в функциональном анализе, исследованиях антител, разработке лекарств и других областях.С развитием биотехнологии и технологии синтеза пептидов разрабатывается и применяется в клинике все больше пептидных препаратов.
Существует большое разнообразие модификаций пептидов, которые можно просто разделить на постмодификацию и модификацию процесса (с использованием модификации производных аминокислот), а также N-концевую модификацию, С-концевую модификацию, модификацию боковой цепи, модификацию аминокислот, модификацию скелета и т. д. и т. д. в зависимости от места модификации (рис. 1).В качестве важного средства изменения структуры основной цепи или групп боковых цепей пептидных цепей модификация пептидов может эффективно изменять физические и химические свойства пептидных соединений, увеличивать растворимость в воде, продлевать время действия in vivo, изменять их биологическое распределение, устранять иммуногенность. , уменьшить токсические побочные эффекты и т. д. В этой статье представлены несколько основных стратегий модификации пептидов и их характеристики.
1. Циклизация
Циклические пептиды имеют множество применений в биомедицине, и многие природные пептиды с биологической активностью являются циклическими пептидами.Поскольку циклические пептиды имеют тенденцию быть более жесткими, чем линейные пептиды, они чрезвычайно устойчивы к пищеварительной системе, могут выживать в пищеварительном тракте и проявлять более сильное сродство к целевым рецепторам.Циклизация — наиболее прямой путь синтеза циклических пептидов, особенно пептидов с большим структурным скелетом.В зависимости от режима циклизации его можно разделить на тип боковой цепи-боковой цепи, тип терминала-боковой цепи, тип терминала-конца (сквозной тип).
(1) сайдчейн к сайдчейну
Наиболее распространенным типом циклизации между боковыми цепями является образование дисульфидных мостиков между остатками цистеина.Эта циклизация происходит за счет снятия защиты с пары цистеиновых остатков, а затем их окисления с образованием дисульфидных связей.Полициклический синтез может быть достигнут путем селективного удаления сульфгидрильных защитных групп.Циклизацию можно проводить либо в растворителе после диссоциации, либо на смоле для предварительной диссоциации.Циклизация на смолах может быть менее эффективной, чем циклизация в растворителе, поскольку пептиды на смолах с трудом образуют циклифицированные конформации.Другой тип циклизации боковой цепи - боковая цепь - это образование амидной структуры между остатком аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты и основной аминокислотой, что требует, чтобы защитная группа боковой цепи могла избирательно удаляться из полипептида либо на смоле или после диссоциации.Третий тип циклизации боковой цепи – боковая цепь – это образование дифениловых эфиров тирозином или п-гидроксифенилглицином.Этот тип циклизации в натуральных продуктах встречается только в микробных продуктах, а продукты циклизации часто имеют потенциальную медицинскую ценность.Получение этих соединений требует уникальных условий реакции, поэтому их не часто используют в синтезе обычных пептидов.
(2) терминал-сайдчейн
Циклизация концевой боковой цепи обычно включает С-конец с аминогруппой боковой цепи лизина или орнитина или N-конец с боковой цепью аспарагиновой или глутаминовой кислоты.Циклизация других полипептидов осуществляется путем образования эфирных связей между концевым C и боковыми цепями серина или треонина.
(3) Тип терминала или типа «голова к хвосту»
Цепные полипептиды могут быть либо подвергнуты циклированию в растворителе, либо зафиксированы на смоле путем циклирования боковой цепи.При централизации растворителя следует использовать низкие концентрации пептидов, чтобы избежать олигомеризации пептидов.Выход полипептида с синтетическим кольцом «голова к хвосту» зависит от последовательности полипептида цепи.Поэтому, прежде чем готовить циклические пептиды в больших масштабах, сначала следует создать библиотеку возможных цепных ведущих пептидов, а затем провести циклизацию, чтобы найти последовательность с наилучшими результатами.
2. N-метилирование
N-метилирование изначально происходит в природных пептидах и вводится в синтез пептидов для предотвращения образования водородных связей, тем самым делая пептиды более устойчивыми к биодеградации и клиренсу.Синтез пептидов с использованием производных N-метилированных аминокислот является важнейшим методом.Кроме того, также можно использовать реакцию Мицунобу промежуточных продуктов полипептида и смолы N-(2-нитробензолсульфонилхлорид) с метанолом.Этот метод был использован для получения библиотек циклических пептидов, содержащих N-метилированные аминокислоты.
3. Фосфорилирование
Фосфорилирование — одна из наиболее распространенных посттрансляционных модификаций в природе.В клетках человека более 30% белков фосфорилированы.Фосфорилирование, особенно обратимое фосфорилирование, играет важную роль в контроле многих клеточных процессов, таких как передача сигнала, экспрессия генов, регуляция клеточного цикла и цитоскелета, а также апоптоз.
Фосфорилирование можно наблюдать по различным аминокислотным остаткам, но наиболее распространенными мишенями фосфорилирования являются остатки серина, треонина и тирозина.Производные фосфотирозина, фосфотреонина и фосфосерина могут быть либо введены в пептиды во время синтеза, либо образованы после синтеза пептидов.Селективного фосфорилирования можно добиться, используя остатки серина, треонина и тирозина, которые избирательно удаляют защитные группы.Некоторые реагенты фосфорилирования также могут вводить в полипептид группы фосфорной кислоты путем постмодификации.В последние годы сайт-специфическое фосфорилирование лизина было достигнуто с использованием химически селективной реакции Штаудингера-фосфита (рис. 3).
4. Миристоилирование и пальмитоилирование.
Ацилирование N-конца жирными кислотами позволяет пептидам или белкам связываться с клеточными мембранами.Миридамоилированная последовательность на N-конце позволяет протеинкиназам семейства Src и белкам обратной транскриптазы Gaq нацеливаться на связывание с клеточными мембранами.Миристиновую кислоту связывали с N-концом смолы-полипептида с использованием стандартных реакций сочетания, и полученный липопептид можно было диссоциировать в стандартных условиях и очистить с помощью ОФ-ВЭЖХ.
5. Гликозилирование
Гликопептиды, такие как ванкомицин и тейколанин, являются важными антибиотиками для лечения устойчивых к лекарствам бактериальных инфекций, а другие гликопептиды часто используются для стимуляции иммунной системы.Кроме того, поскольку многие микробные антигены гликозилированы, большое значение имеет изучение гликопептидов для улучшения терапевтического эффекта инфекции.С другой стороны, было обнаружено, что белки клеточной мембраны опухолевых клеток демонстрируют аномальное гликозилирование, что заставляет гликопептиды играть важную роль в исследованиях иммунной защиты рака и опухолей.Гликопептиды получают методом Fmoc/t-Bu.Гликозилированные остатки, такие как треонин и серин, часто вводятся в полипептиды с помощью fMOC, активированных эфиром пентафторфенола, для защиты гликозилированных аминокислот.
6. Изопрен
Изопентадиенилирование происходит по остаткам цистеина в боковой цепи вблизи С-конца.Белок изопрен может улучшить сродство к клеточной мембране и сформировать белок-белковое взаимодействие.Изопентадиенированные белки включают тирозинфосфатазу, малую GTазу, молекулы кошаперона, ядерную пластинку и центромерные связывающие белки.Изопреновые полипептиды можно получить, используя изопрен на смолах или вводя производные цистеина.
7. Модификация полиэтиленгликоля (ПЭГ).
Модификацию ПЭГ можно использовать для улучшения гидролитической стабильности белка, биораспределения и растворимости пептидов.Введение цепей ПЭГ в пептиды позволяет улучшить их фармакологические свойства, а также ингибировать гидролиз пептидов протеолитическими ферментами.Пептиды ПЭГ легче проходят через поперечное сечение капилляров клубочков, чем обычные пептиды, что значительно снижает почечный клиренс.Благодаря увеличенному периоду полувыведения ПЭГ-пептидов in vivo нормальный уровень лечения можно поддерживать с помощью более низких доз и менее частого применения пептидных препаратов.Однако модификация ПЭГ имеет и отрицательные последствия.Большие количества ПЭГ предотвращают расщепление пептида ферментом, а также уменьшают связывание пептида с целевым рецептором.Но низкое сродство ПЭГ-пептидов обычно компенсируется их более длительным фармакокинетическим периодом полураспада, а поскольку они дольше присутствуют в организме, ПЭГ-пептиды имеют большую вероятность абсорбции в тканях-мишенях.Следовательно, характеристики полимера ПЭГ должны быть оптимизированы для достижения оптимальных результатов.С другой стороны, пептиды ПЭГ накапливаются в печени из-за снижения почечного клиренса, что приводит к макромолекулярному синдрому.Следовательно, модификации ПЭГ необходимо разрабатывать более тщательно, когда пептиды используются для тестирования лекарств.
Общие группы модификаций модификаторов ПЭГ можно грубо резюмировать следующим образом: Амино(-амин)-NH2, аминометил-Ch2-NH2, гидрокси-OH, карбокси-Cooh, сульфгидрил (-Тиол)-SH, малеимид-MAL, сукцинимид карбонат - SC, ацетат сукцинимида -SCM, пропионат сукцинимида -SPA, н-гидроксисукцинимид -NHS, акрилат-ch2ch2cooh, альдегид -CHO (например, пропиональд, бутирАЛД), акриловая основа (-акрилат-акрл), азидоазид, биотинил - Биотин, флуоресцеин, глутарил-GA, акрилат-гидразид, алкин-алкин, п-толуолсульфонат-ОТс, сукцинимид-сукцинат-SS и др. Производные ПЭГ с карбоновыми кислотами могут быть связаны с n-концевыми аминами или боковыми цепями лизина.Аминоактивированный ПЭГ может быть связан с боковыми цепями аспарагиновой или глутаминовой кислоты.Маль-активированный ПЭГ может быть конъюгирован с меркаптаном полностью лишенных защиты боковых цепей цистеина [11].Модификаторы ПЭГ обычно классифицируются следующим образом (примечание: мПЭГ представляет собой метокси-ПЭГ, CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH):
(1) модификатор ПЭГ с прямой цепью
mPEG-SC, mPEG-SCM, mPEG-SPA, mPEG-OTs, mPEG-SH, mPEG-ALD, mPEG-butyrALD, mPEG-SS
(2) бифункциональный модификатор ПЭГ
HCOO-ПЭГ-СООН, NH2-ПЭГ-NH2, OH-ПЭГ-СООН, OH-ПЭГ-NH2, HCl·NH2-ПЭГ-СООН, МАЛ-ПЭГ-NHS
(3) разветвляющийся модификатор PEG
(мПЭГ)2-NHS, (мПЭГ)2-АЛД, (мПЭГ)2-NH2, (мПЭГ)2-MAL
8. Биотинизация
Биотин может прочно связываться с авидином или стрептавидином, причем сила связывания даже близка к ковалентной связи.Пептиды, меченные биотином, обычно используются в иммуноанализе, гистоцитохимии и проточной цитометрии на основе флуоресценции.Меченые антитела к биотину также можно использовать для связывания биотинилированных пептидов.Метки биотина часто прикрепляются к боковой цепи лизина или N-концу.6-аминокапроновая кислота часто используется в качестве связи между пептидами и биотином.Связь гибкая при связывании с субстратом и лучше связывается при наличии стерических препятствий.
9. Флуоресцентная маркировка
Флуоресцентное мечение можно использовать для отслеживания полипептидов в живых клетках, а также для изучения ферментов и механизмов действия.Триптофан (Trp) флуоресцентен, поэтому его можно использовать для внутренней маркировки.Спектр излучения триптофана зависит от периферической среды и уменьшается с уменьшением полярности растворителя - свойство, которое полезно для определения структуры пептида и связывания рецептора.Флуоресценция триптофана может быть подавлена протонированной аспарагиновой кислотой и глутаминовой кислотой, что может ограничить его использование.Группа дансилхлорида (Дансил) обладает высокой флуоресценцией при связывании с аминогруппой и часто используется в качестве флуоресцентной метки для аминокислот или белков.
Флуоресцентный резонанс Преобразование энергии (FRET) полезно для исследований ферментов.При применении FRET полипептид-субстрат обычно содержит группу, маркирующую флуоресценцию, и группу, тушащую флуоресценцию.Меченые флуоресцентные группы гасятся тушителем за счет нефотонной передачи энергии.Когда пептид диссоциирует от рассматриваемого фермента, метящая группа излучает флуоресценцию.
10. Клеточные полипептиды
Клеточные пептиды имеют оптически удаляемые защитные группы, которые защищают пептид от связывания с рецептором.Под воздействием УФ-излучения пептид активируется, восстанавливая свое сродство к рецептору.Поскольку эту оптическую активацию можно контролировать по времени, амплитуде или местоположению, клеточные пептиды можно использовать для изучения реакций, происходящих в клетках.Наиболее часто используемыми защитными группами клеточных полипептидов являются 2-нитробензильные группы и их производные, которые можно вводить в синтез пептидов через производные защитных аминокислот.Разработаны производные аминокислот: лизин, цистеин, серин и тирозин.Однако производные аспартата и глутамата обычно не используются из-за их склонности к циклизации во время синтеза и диссоциации пептидов.
11. Полиантигенный пептид (МАП).
Короткие пептиды обычно не обладают иммунитетом и должны быть связаны с белками-носителями для образования антител.Полиантигенный пептид (MAP) состоит из множества идентичных пептидов, связанных с ядрами лизина, которые могут специфически экспрессировать высокоэффективные иммуногены и могут использоваться для получения пар пептид-белок-носитель.Полипептиды MAP можно синтезировать твердофазным синтезом на смоле MAP.Однако неполное связывание приводит к отсутствию или усечению пептидных цепей на некоторых ветвях и, таким образом, не проявляет свойств исходного полипептида MAP.В качестве альтернативы пептиды можно получить и очистить отдельно, а затем соединить с MAP.Пептидная последовательность, прикрепленная к пептидному ядру, четко определена и легко охарактеризована с помощью масс-спектрометрии.
Заключение
Модификация пептидов является важным средством создания пептидов.Химически модифицированные пептиды могут не только сохранять высокую биологическую активность, но и эффективно избегать недостатков иммуногенности и токсичности.В то же время химическая модификация может придать пептидам некоторые новые превосходные свойства.В последние годы быстро развивается метод активации ЦГ для постмодификации полипептидов и достигнуто множество важных результатов.
Время публикации: 20 марта 2023 г.